通用名称

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（荧光探针法，免提取）

主要成分

作用与用途

本试剂盒用于定性检测非洲猪瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV）特异性核酸片段，为临床监测和诊断非洲猪瘟病毒感染猪提供检测数据。非洲猪瘟确诊应根据临床症状，流行病学及实验室检测结果进行综合判定。

检测原理

本试剂盒以PCR方法结合荧光探针，核酸提取与纯化同步操作，直接通过实时监测PCR扩增产物的累积过程中荧光信号的变化对非洲猪瘟病毒(African swinefevervirus，ASFV)的特异性核酸片段进行检测。

用法

1. 适用样本类型本试剂盒适用于猪口鼻眼拭子、组织和血液或血清等样本中非洲猪瘟病毒的核酸检测。

2. 样本采集

2.1 口鼻眼拭子样本的采集：采集患病猪口鼻眼拭子样本，用专用采样棉签，适度拭抹口腔分泌物和鼻腔分泌物，眼分泌物要用拭子在眼睑下充分擦拭，迅速将棉签放入装有400μL样本稀释液的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。拭子采样以溶解到样本稀释液中可以看到组织悬浮物为最佳。

2.2 组织样本的采集：无菌采集病猪组织样本约0.1g，置于1.5mL无菌离心管中。

2.3 全血样本的采集：抽取猪静脉血1mL，置于含有适量抗凝剂的采血管中（抗凝剂建议采用EDTA或柠檬酸三钠，不应采用肝素）；

2.4 血清样本的采集：抽取猪静脉血1mL,注入无菌收集管中，室温不超过4小时（约30-60分钟），待样本自行析出血清，或直接1600rpm离心5分钟分离出血清，转移至新的灭菌离心管中备用。

3. 保存

采集的待测样本可立即用于检测，待测样本在2～8℃保存不应超过三天；-20±5℃保存不超过一个月；-70℃以下可以长期保存。应避免反复冻融。

操作程序

1. 扩增试剂准备

从试剂盒中取出ASFV-PCR反应液、ASFV-阴性对照品和ASFV-阳性对照品，待所有组分完全溶解后，振荡混匀5秒，瞬时离心5秒。

2. 样本处理

2.1 口鼻眼拭子样本处理：无需样本处理，即可直接上样。

2.2 组织样本处理：取约黄豆粒大小组织样本（约0.1g）置于无菌1.5mL离心管中，加入200μL样本稀释液，使用手持式组织研磨仪充分研磨至匀浆。另取出一个新的无菌1.5mL离心管，加入30μL组织样本裂解液，再加入30μL组织匀浆液，涡旋混匀，置于95℃加热5min后，12000rpm离心2min，吸取上清液5μL上样。

2.3 血液样本处理：

全血样本处理：经样本稀释液稀释10倍后，即可直接上样；

血清样本处理：经样本稀释液稀释5倍后，即可直接上样。

3.  加样

按下表体系，在0.2mLPCR管中配制反应液。试剂用毕后将剩余试剂立即放入-20±5℃保存。

3.1 在一个分装有反应液的PCR反应管中加入5μL的ASFV-阴性对照品；

3.2 将步骤2.样本处理中取得的待检样本充分震荡混匀，然后按照5μL/样本分别加入分装有反应液的PCR反应管中；

3.3 在最后一个分装有反应液的PCR反应管中加入5μL的ASFV-阳性对照品；

以上操作建议在冰浴条件下进行，操作完毕压紧管盖，瞬时离心。

注：使用卡尤迪生物科技Mini8全系列荧光定量PCR仪时，建议使用无色透明的0.2mLPCR管，切勿使用有颜色，磨砂的PCR管，因为该仪器荧光读取方式为侧面激发和收集荧光信号。

4. PCR扩增

将反应管放置到PCR检测仪内，记录加样顺序。

4.1 按下表设置反应条件

4.2 荧光通道的选择

请选择FAM通道检测ASFV的核酸。

判定

1. 试验成立条件：

1.1 阴性对照品FAM检测通道无S型扩增曲线；

1.2 阳性对照品FAM检测通道有典型S型扩增曲线且Ct值≤23；

1.3 阴、阳性对照品检测符合上述结果，则实验有效。

2. 结果判定

2.1 如果样本在FAM 通道有典型S型扩增曲线且Ct值≤23，则判定为非洲猪瘟病毒核酸检测阳性；

2.2 如果FAM通道有典型S型扩增曲线且 Ct值在23-30之间，则需要复检。复检结果如果样本FAM 通道仍有典型S型扩增曲线且Ct值≤30，则判定为非洲猪瘟病毒核酸检测阳性，否则为阴性。

注意事项

1. 开始检测前请仔细阅读本说明书，按要求操作。

2. 各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染；实验后立即清洁工作台。

3. 扩增产物的污染，很容易出现假阳性结果。因此，临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员。

4. 本试剂盒检测结果仅供科研使用，对病猪的临床诊治应结合其症状/体征，病史，其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

5. 检测为阴性，并不代表为非感染状态，具体诊断结果须结合其他临床诊断结果判断。造成检测为阴性的可能是：①不合理样本采集、转运及处理、样本中病毒浓度过低，②未经验证的其他干扰因素如：服用抗病毒药物等。

6. 样本中DNA浓度低于本产品的最低检出限时可能出现假阴性。

7. 核酸反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各荧光定量PCR反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

储存与有效期

本试剂盒中样本裂解液和样本稀释液应储存于 2～8℃；其余组份应储存于-20±5℃的避光条件，有效期为12个月，尽量避免反复冻融。